Terapia Epigenómica en Hemofilia B

 

Tema	Antitrombina (AT) dirigida terapéutica con ARNi en investigación para el tratamiento de la hemofilia B
Mecanismo Epigenético tratado	RNA de interferencia (en la traducción de antitrombina)
¿Cómo se lo hizo?	Fitusiran (AT3 ARNi) es un agente terapéutico de interferencia de ARN administrado por vía subcutánea que se dirige a la AT en el hígado e interfiere con la traducción de antitrombina al unirse y degradar el ARN AT mensajero. Silencia así la expresión del gen antitrombina; por lo tanto los niveles de AT circulantes disminuyen lo que ocasiona el aumento de niveles de trombina.
Resultados	·     El aumento gradual de la dosis de fitusiran ha mejorado la generación de trombina y la hemostasia clínica ·     Reduce la frecuencia de hemorragias en personas con hemofilia B de moderada a grave, independientemente del estado del inhibidor

Referencias Bibliográficas

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6110283/

Técnicas de Edición de Ácidos Nucleicos en Hemofilia B

 

Tipo de Edición	In vivo-somática
Dirigido hacia	Gen FIX humano (38kb)
Dirigidas por	· ZFN (nucleasas de dedos de zinc) · CRISPR/Cas9 · gRNA = RNA que guía la inserción
Uso de vectores	·Vector adenoviral (Ad5-Cas9-gRNA) ·Vector rAAV ·Ad5-EF1α-mFIX
Órgano/célula a tratar	Hígado, hepatocitos
Vía de administración	Parenteral (inyección intravenosa)
Resultados	Corto plazo: siete días después de una sola inyección, los niveles plasmáticos de mFIX de todos los ratones inyectados estaban dentro del rango de hemofilia "leve"  Mediano plazo: los primeros 80 días después se estabilizaron los niveles de proteína Largo plazo: El ADNc de mFIX integrado en el objetivo era detectable 245 días después de la inyección (dpi) con eventos de integración sin errores y que contenían errores.

Referencia Bibliográfica

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168365919300823

Terapia con Stem Cells en Hemofilia B

Tipo de Stem Cell	iPSC (célula madre pluripotente inducida)
Método de obtención	En un paciente con hemofilia B, se generan iPSC a partir de células mononucleares de sangre periférica por reprogramación mediante el cocktail de OCT4, SOX2 y NANOG. Se inserta ADNc de F9 humano de longitud completa en el locus AAVS1 de iPSC y después se reprograma en hepatocitos, insertando marcadores hepáticos (AFP, ALB, HNF4α, TDO2, TAT y CYP3A4)
Vía de administración	Parenteral (inyección esplénica)
Resultado	Secreta hFIX (factor IX humano) de forma estable a corto plazo y se sigue investigando para que los efectos del factor sean de larga duración.

Referencia Bibliográfica

https://stemcellres.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13287-018-0839-8

ADN Recombinante

1.Ejemplo de ADN recombinante en la naturaleza

Las bacterias tienen 3 procesos de recombinación: Transformación, transducción y conjugación; estos mecanismos muestran la capacidad para adaptarse ante situaciones de riesgo, como es el caso de antibióticos, de tal manera desarrollan cierta resistencia transmisible mediada por plásmidos, transposones o integrones que pueden pasar de una bacteria a otra. (Ej. Bacterias gramnegativas: resistentes a B-lactamasa)(1)(2)

2.Ejemplo de ADN recombinante en Hemofilia B

Factor IX Alfa nonacog es un fármaco que se usa en el tratamiento y profilaxis de las hermorragias en pacientes con hemofilia B, este es un factor producido por tecnología de ADN recombinante en células de ovario de hámster chino (3)(4)

3. Ejemplo de Transgénico animal o vegetal

El arroz dorado es un alimento transgénico que contiene vitamina A buscando la disminución de enfermedades relacionadas con la deficiencia de dicha vitamina, este producto ha sido aceptado en varios lugares, como Filipinas (5)(6)

Referencias Bibliográficas

1. https://www.mscbs.gob.es/gl/biblioPublic/publicaciones/docs/bacterias.pdf
2. https://core.ac.uk/download/pdf/85158379.pdf
3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3575125/
4. https://www.aeped.es/comite-medicamentos/pediamecum/factor-ix-nonacog-alfa
5. https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=2348798
6. https://www.bioeconomia.info/2019/12/19/el-arroz-transgenico-enriquecido-con-vitamina-a-muy-cerca-de-poder-consumirse-en-filipinas/

Técnica molecular Epigenómica en Hemofilia B

En un par de gemelas con hemofilia B, se demostró que variaba su sintomatología debido a la metilación del gen; en una de ellas era leve y en otra grave. Esta investigación se realizó a partir de ADN genómico donde se analizó F9 (exón 8) y se amplificó mediante HpaII-PCR sensible a la metilación utilizando polimorfismos ligados a X en el gen de la fosfoglicerato quinasa 1 humana (PGK1) y el gen AMPA 3 ionotrópico del receptor de glutamato (GRIA3) y luego se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%.

Se demostró que el grado de desviación de la inactivación de X materna está estrechamente correlacionado con los parámetros de coagulación y los fenotipos clínicos de los gemelos. 

Referencias Bibliográficas

https://ci.nii.ac.jp/naid/500000471715/

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18540891/

Pruebas de Tamizaje y Confirmatoria en Hemofilia B

Prueba de Tamizaje

De manera general el mayor determinante será la deficiencia del factor IX

1.   1.Antecedentes familiares

2.    2.Signos y Síntomas

a.  Cuando son casos graves se manifiestan sangrados no provocados, o en casos moderados, tienden a sangrar por un trauma
b.   Hemartrosis (sangrado en los espacios articulares), comúnmente la rodilla y el codo
c.   Hematomas intramusculares
d.   Hemorragia cerebral, es una de las complicaciones más graves (en casos graves son espontáneos)
e.      Portadoras sintomáticas: Menorragias (periodos menstruales anormalmente prolongados e intensos)

 

 3.Pruebas diagnósticas:

a.  Hemograma completo (CBC): Es un análisis cuantitativo de hemoglobina, glóbulos rojos, blancos y plaquetas (suele ser normal en pacientes hemofílicos)
b.  Prueba de tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT): miden el tiempo de coagulación, principalmente en función de las capacidades de coagulación de FVIII, FIX, FXI y FXII. Los tiempos normales son de 25 a 35 s, y en estos casos se prolonga la coagulación hasta 2.5
c.  Prueba de tiempo de protrombina (PT): miden el tiempo de coagulación, principalmente en función de las capacidades de coagulación de FI (fibrinógeno), FII (protrombina), FV, FVII y FX. Los resultados para pacientes con hemofilia B no se ven afectados.
d.  Prueba de fibrinógeno: que miden el tiempo de coagulación en función de la actividad de fibrinógeno, se utilizan cuando los resultados de APTT y PT son anormales.

e.  Pruebas de los factores de coagulación: determina la actividad de los factores de coagulación individuales (indica el tipo de hemofilia y gravedad)

 

 Prueba Confirmatoria:

La secuenciación es la estrategia de elección para determinar molecularmente y genéticamente la alteración ya que se visualiza de forma directa el gen del factor IX y cómo se encuentra. Recientemente, se añaden nuevas técnicas, como la amplificación de sonda dependiente de la ligadura múltiple (MLPA) y la hibridación de sonda (MAPH)

Es muy importante este tipo de prueba ya que se pueden establecer subdivisiones de la hemofilia B, por ejemplo si se reconoce una alteración en el promotor se diagnosticará como hemofilia B de Leyden

Referencias Bibliográficas

• https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28243977/
• https://www.cdc.gov/ncbddd/spanish/hemophilia/diagnosis.html#:~:text=Si%20un%20reci%C3%A9n%20nacido%20muestra,se%20coagula%20de%20manera%20adecuada.

Prueba de Secuenciación en Hemofilia B

En el caso del gen FIX la secuenciación es un método de diagnóstico molecular accesible por el tamaño de sus regiones codificadora y promotora donde se localizan más del 96% del total de las mutaciones causantes de hemofilia B.

Una familia realiza esta prueba para confirmar hemofilia B en un niño que presenta sintomatología; más tarde se examina a todos los integrantes de la familia.

Se extrae sangre periférica para analizar el DNA genómico del infante, donde se enfocó en todas las secuencias de exón y secuencias de flanco del gen del factor IX mediante la técnica de Sanger. Según el gen mutado del individuo, se comparó a la familia

La secuenciación de Sanger reveló la mutación c.1232G> C [p.Ser411Thr] en el gen F9 en el proband.

También se encontró en la madre y la abuela del candidato c.1232G> C mutación heterocigota, pero los miembros masculinos de la familia sin hemofilia B no tenían esta mutación.

Referencias Bibliográficas

https://journals.lww.com/md-journal/Fulltext/2019/05240/Genetic_analysis_of_a_hemophilia_B_family_with_a.22.aspx

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en Hemofilia B

Tema	Estudio molecular de las Hemofilias A y B en Cuba
Objetivos	Diagnóstico: Identificar familias informativas para los marcadores Ddel, Hhal, TaqI y Mnl I mediante técnicas moleculares para el diagnóstico de Hemofilia B y de esta manera confeccionar los haplotipos para un futuro diagnóstico prenatal
Tipo de muestra	Sangre  o líquido amniótico
Tipo de ácido nucleico	ADN genónimo
Gen secuencia	Gen del factor IX (38kb)
PCR	PCR estándar, 35 ciclos: Desnaturalización: 95°C x 30 seg Hibridación:  55°C x 30 seg Extensión: 72°C x 30 seg
Visualización	Electroforesis en gel de agarosa al 2 o 3 % según las tallas de los fragmentos esperados y visualizado en un transiluminador de luz ultravioleta

Referencias Bibliográficas

http://revhematologia.sld.cu/index.php/hih/article/viewFile/825/633

Alteraciones en la Epigenética de la Hemofilia B

En el gen del factor IX se puede involucrar cambios en dinucleótidos como CG por TG o CA en las islas CpG que son consideradas puntos hotspot por desaminación o metilación espontánea de las citosinas.

La metilación del ADN ocurre principalmente en el residuo del C de este dinucleótido, donde una C se transforma fácilmente en una T a través del proceso de desaminación. 

También se puede ver mutados los genes Xist y Tsix que inactivarán una copia X; en el caso de las mujeres esto ocasionará la presentación de síntomas hemorrágicos. Se postula que la base de estas regulaciones está en los procesos de metilación del ADN.

Referencias Bibliográficas

http://bdigital.unal.edu.co/71392/1/TESIS%20HEMOFILIA%20B%20-%20Yolima%20Andrea.pdf

https://repositorio.uniandes.edu.co/bitstream/handle/1992/38705/u808140.pdf?sequence=1

Alteraciones en la Traducción de la Hemofilia B

Se ha sugerido que ciertas variantes como la adición de 4 aminoácidos (Gly, His, Asn y Leu) pueden inducir una reducción de la traducción debido a una disminución en la frecuencia de uso del codón preferencial del residuo, lo que lleva a un enlentecimiento de la traducción, que modifica la conformación de la proteína y limita su expresión final.

También puede sufrir modificaciones post‐traduccionales mediadas por la enzima carboxilasa dependiente de vitamina K.

 Bibliografía

https://ri.conicet.gov.ar/handle/11336/82948

https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/69526

http://revhematologia.sld.cu/index.php/hih/article/viewFile/825/633

Alteraciones en la Transcripción de la Hemofilia B

El gen del FIX tiene 8 exones, que se pueden ver afectados por alteraciones tipo puntuales, deleciones, duplicaciones, inserciones, rearreglos, indels, nonsense, frameshift, missense y polimorfismos

• Más específicamente en la región promotora del axón 8, se encuentran variantes que alteran la transcripción de las zonas de unión del Factor IX y que se asocian al fenotipo llamado Hemofilia de Leyden
  
• Otro tipo de alteración involucra cambios en dinucleótidos como CG por TG o CA en las islas CpG que son consideradas puntos Hotspot por desaminacion o metilación espontaneas de las citosinas en estos puntos
• Las mutaciones en la porción carboxiterminal del FIX generan una secreción deficiente de factor desde el hepatocito

Bibliografía

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0864-02892012000200002

http://bdigital.unal.edu.co/71392/1/TESIS%20HEMOFILIA%20B%20-%20Yolima%20Andrea.pdf

http://www1.wfh.org/publication/files/pdf-1193.pdf

Alteraciones Genómicas de la Hemofilia B

La hemofilia es una enfermedad causada por una mutaciòn en un gen ubicado en el cromosoma X, dentro de sus tipos la hemofilia B o Enfermedad de Christmas (Navidad en inglés) está causada por mutaciones en el gen Xq27, que codifica para el factor de coagulación IX.

Se observa una alta frecuencia de mutaciones por cambio de un solo nucleótido, ampliamente distribuidas dentro de la secuencia génica, asociadas a cambios de falso sentido (missense), cambios a no sentido (nonsense) y cambios del marco de lectura (frameshifts). 

Referencias

https://www.orpha.net/consor/cgi-bin/OC_Exp.php?lng=ES&Expert=98879

http://scielo.sld.cu/pdf/hih/v28n2/hih02212.pdf

La hemofilia, una enfermedad ligada al cromosoma X

La hemofilia es causada por una mutación o cambio en uno de los genes que da las instrucciones para producir las proteínas del factor de la coagulación necesarias para formar un coágulo de sangre; este cambio o mutación puede hacer que las proteínas de la coagulación no funcionen correctamente o que directamente no estén presentes. 

Estos genes se localizan en el cromosoma X. Los hombres tienen un cromosoma X y un cromosoma Y (XY) y las mujeres tienen dos cromosomas X (XX). 

El cromosoma X contiene muchos genes que no están presentes en el cromosoma Y. Eso significa que los hombres tienen solo una copia de la mayoría de los genes del cromosoma X, mientras que las mujeres tienen dos copias. Por lo tanto, los hombres pueden tener una enfermedad como la hemofilia si heredan un cromosoma X afectado que tenga una mutación en el gen del factor VIII o del factor IX. Las mujeres también pueden tener hemofilia, pero esto es mucho menos frecuente. En esos casos, los dos cromosomas X se ven afectados, o uno es afectado y el otro no está presente o está inactivo. En estas mujeres los síntomas de la hemorragia pueden ser similares a los de los hombres con hemofilia.

Una mujer con un cromosoma X afectado es una “portadora” de hemofilia. A veces una mujer que es portadora puede tener síntomas de hemofilia. Además, puede transmitir el cromosoma X afectado por la mutación del gen del factor de coagulación a sus hijo 

Referencias

https://www.cdc.gov/ncbddd/spanish/hemophilia/facts.html

https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n4794_Radic.pdf

HEMOFILIA

La hemofilia es una enfermedad genética (ligada al cromosoma X) en la que las manifestaciones clínicas consisten básicamente en la presencia de hemorragias. 

Se conocen dos tipos de hemofilia: 

• A: Deficiencia del factor VIII de la coagulación
• B: Deficiencia del factor IX de la coagulación 

REFERENCIAS

https://www.medigraphic.com/cgi-bin/new/resumen.cgi?IDARTICULO=46631 

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