Técnicas de Edición de Ácidos Nucleicos en Hemofilia B

 

Tipo de Edición	In vivo-somática
Dirigido hacia	Gen FIX humano (38kb)
Dirigidas por	· ZFN (nucleasas de dedos de zinc) · CRISPR/Cas9 · gRNA = RNA que guía la inserción
Uso de vectores	·Vector adenoviral (Ad5-Cas9-gRNA) ·Vector rAAV ·Ad5-EF1α-mFIX
Órgano/célula a tratar	Hígado, hepatocitos
Vía de administración	Parenteral (inyección intravenosa)
Resultados	Corto plazo: siete días después de una sola inyección, los niveles plasmáticos de mFIX de todos los ratones inyectados estaban dentro del rango de hemofilia "leve"  Mediano plazo: los primeros 80 días después se estabilizaron los niveles de proteína Largo plazo: El ADNc de mFIX integrado en el objetivo era detectable 245 días después de la inyección (dpi) con eventos de integración sin errores y que contenían errores.

Referencia Bibliográfica

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168365919300823

Terapia con Stem Cells en Hemofilia B

Tipo de Stem Cell	iPSC (célula madre pluripotente inducida)
Método de obtención	En un paciente con hemofilia B, se generan iPSC a partir de células mononucleares de sangre periférica por reprogramación mediante el cocktail de OCT4, SOX2 y NANOG. Se inserta ADNc de F9 humano de longitud completa en el locus AAVS1 de iPSC y después se reprograma en hepatocitos, insertando marcadores hepáticos (AFP, ALB, HNF4α, TDO2, TAT y CYP3A4)
Vía de administración	Parenteral (inyección esplénica)
Resultado	Secreta hFIX (factor IX humano) de forma estable a corto plazo y se sigue investigando para que los efectos del factor sean de larga duración.

Referencia Bibliográfica

https://stemcellres.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13287-018-0839-8

ADN Recombinante

1.Ejemplo de ADN recombinante en la naturaleza

Las bacterias tienen 3 procesos de recombinación: Transformación, transducción y conjugación; estos mecanismos muestran la capacidad para adaptarse ante situaciones de riesgo, como es el caso de antibióticos, de tal manera desarrollan cierta resistencia transmisible mediada por plásmidos, transposones o integrones que pueden pasar de una bacteria a otra. (Ej. Bacterias gramnegativas: resistentes a B-lactamasa)(1)(2)

2.Ejemplo de ADN recombinante en Hemofilia B

Factor IX Alfa nonacog es un fármaco que se usa en el tratamiento y profilaxis de las hermorragias en pacientes con hemofilia B, este es un factor producido por tecnología de ADN recombinante en células de ovario de hámster chino (3)(4)

3. Ejemplo de Transgénico animal o vegetal

El arroz dorado es un alimento transgénico que contiene vitamina A buscando la disminución de enfermedades relacionadas con la deficiencia de dicha vitamina, este producto ha sido aceptado en varios lugares, como Filipinas (5)(6)

Referencias Bibliográficas

1. https://www.mscbs.gob.es/gl/biblioPublic/publicaciones/docs/bacterias.pdf
2. https://core.ac.uk/download/pdf/85158379.pdf
3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3575125/
4. https://www.aeped.es/comite-medicamentos/pediamecum/factor-ix-nonacog-alfa
5. https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=2348798
6. https://www.bioeconomia.info/2019/12/19/el-arroz-transgenico-enriquecido-con-vitamina-a-muy-cerca-de-poder-consumirse-en-filipinas/

Técnica molecular Epigenómica en Hemofilia B

En un par de gemelas con hemofilia B, se demostró que variaba su sintomatología debido a la metilación del gen; en una de ellas era leve y en otra grave. Esta investigación se realizó a partir de ADN genómico donde se analizó F9 (exón 8) y se amplificó mediante HpaII-PCR sensible a la metilación utilizando polimorfismos ligados a X en el gen de la fosfoglicerato quinasa 1 humana (PGK1) y el gen AMPA 3 ionotrópico del receptor de glutamato (GRIA3) y luego se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%.

Se demostró que el grado de desviación de la inactivación de X materna está estrechamente correlacionado con los parámetros de coagulación y los fenotipos clínicos de los gemelos. 

Referencias Bibliográficas

https://ci.nii.ac.jp/naid/500000471715/

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18540891/

Pruebas de Tamizaje y Confirmatoria en Hemofilia B

Prueba de Tamizaje

De manera general el mayor determinante será la deficiencia del factor IX

1.   1.Antecedentes familiares

2.    2.Signos y Síntomas

a.  Cuando son casos graves se manifiestan sangrados no provocados, o en casos moderados, tienden a sangrar por un trauma
b.   Hemartrosis (sangrado en los espacios articulares), comúnmente la rodilla y el codo
c.   Hematomas intramusculares
d.   Hemorragia cerebral, es una de las complicaciones más graves (en casos graves son espontáneos)
e.      Portadoras sintomáticas: Menorragias (periodos menstruales anormalmente prolongados e intensos)

 

 3.Pruebas diagnósticas:

a.  Hemograma completo (CBC): Es un análisis cuantitativo de hemoglobina, glóbulos rojos, blancos y plaquetas (suele ser normal en pacientes hemofílicos)
b.  Prueba de tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT): miden el tiempo de coagulación, principalmente en función de las capacidades de coagulación de FVIII, FIX, FXI y FXII. Los tiempos normales son de 25 a 35 s, y en estos casos se prolonga la coagulación hasta 2.5
c.  Prueba de tiempo de protrombina (PT): miden el tiempo de coagulación, principalmente en función de las capacidades de coagulación de FI (fibrinógeno), FII (protrombina), FV, FVII y FX. Los resultados para pacientes con hemofilia B no se ven afectados.
d.  Prueba de fibrinógeno: que miden el tiempo de coagulación en función de la actividad de fibrinógeno, se utilizan cuando los resultados de APTT y PT son anormales.

e.  Pruebas de los factores de coagulación: determina la actividad de los factores de coagulación individuales (indica el tipo de hemofilia y gravedad)

 

 Prueba Confirmatoria:

La secuenciación es la estrategia de elección para determinar molecularmente y genéticamente la alteración ya que se visualiza de forma directa el gen del factor IX y cómo se encuentra. Recientemente, se añaden nuevas técnicas, como la amplificación de sonda dependiente de la ligadura múltiple (MLPA) y la hibridación de sonda (MAPH)

Es muy importante este tipo de prueba ya que se pueden establecer subdivisiones de la hemofilia B, por ejemplo si se reconoce una alteración en el promotor se diagnosticará como hemofilia B de Leyden

Referencias Bibliográficas

• https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28243977/
• https://www.cdc.gov/ncbddd/spanish/hemophilia/diagnosis.html#:~:text=Si%20un%20reci%C3%A9n%20nacido%20muestra,se%20coagula%20de%20manera%20adecuada.